Добрый день, дорогие читатели! Многие из нас проходили курс антибактериальной терапии хоть раз в жизни. Однако в большинстве случаев речь шла об антибиотиках. С бактериофагами приходилось сталкиваться не всем. В то же время медики склонны говорить о том, что сегодня эти медикаменты могут стать хорошей альтернативой. Бактериофаги, виды и назначение этих уникальных по своей природе препаратов мы и рассмотрим.

Бактериофаг: что это за лекарство?

История возникновения

История бактериофагов насчитывает около 100 лет. В 1915 -1917 годах их открытие состоялось почти одновременно во Франции, Англии и России, где три биолога, независимо друг от друга, наблюдали явление лизиса бактерий.

После изучения свойств микроскопических вирусом ученый Феликс Д"Эрелль высказал мысль о том, что они играют большую роль в процессе выздоровления организма, пораженного бактериальной инфекцией. С тех пор возникло усиленное внимание к фагам, началось их стремительное изучение.

Строение фага

Фаги не продукт генной инженерии. Они встречаются и в природе, в тех местах, где есть чувствительные к ним бактерии. Строение вируса напоминает головастика: в нем есть хвостик и головка. В последней заложен генетический материал. В состав фага входит белковая оболочка и нуклеиновые кислоты, из которых складывается ДНК.

Особенности каждого бактериофага зависят от того, против каких бактерий он направлен. Замечены случаи, когда вирусы не могут воздействовать даже на бактерии своего класса, поскольку некоторые особи оказываются резистентными к бактериофагам. Чтобы лечиться этими медикаментами, нужно быть точно уверенными в диагнозе: на другие бактерии и микроорганизмы вирусы не действуют.

Как используют?

Довольно часто фаги используют в комплексной антибактериальной терапии. Им отдается преимущество, если нет смертельной угрозы для пациента. В отличие от антибиотиков, «сметающих» все на своем пути, медикаменты с минивирусами не убивают полезную микрофлору, действуют избирательно и безболезненно выводятся из организма.

Их совместимость с любыми лекарствами 100%-ная, поскольку они не вступают в реакцию с другими химическими веществами и не вызывают осложнений. Единственным исключением является прием лекарств, включающих бактерии, например, Линекс, Аципол, Бифидум-бактерин.

Тем не менее, в рамках экстренной терапии фаги пока не могут заменить антибиотики, так как не всегда есть возможность точно установить возбудителя. Многие фаги можно давать детям даже в грудном возрасте, когда большинство антибиотиков запрещены. В детской терапии медикаменты на основе вирусных агентов более предпочтительны, так как имеют меньший объем побочных эффектов.

Виды бактериофагов

В современной медицине бактериофаги используют во многих сферах:

• гастроэнтерологии;
• отоларингологии;
• хирургии;
• гинекологии;
• урологии;
• пульмонологии.

Выбор конкретного медикамента зависит от заболевания и его возбудителя.

Каждый фаг может быть направлен только против конкретной бактерии, причем имеет место территориальная избирательность. Это означает, что бактерии и вирусы поддаются мутациям в зависимости от территории, на которой они находятся.

Классификация фагов осуществляется по возбудителям. При наличии одной инфекции используют:

Стафилококковый бактериофаг

Действует только против стафилококка, охватывая различные его виды, включая золотистый.

Интести

Эффективен против нескольких видов бактерий: кишечная палочка, энтерококк, стафилококк, синегнойная палочка, протей.

Поливалентный

Действует против кишечной палочки, синегнойной палочки, клебсиелл, протея.

Стрептококковый

Действует исключительно при стрептококковой моноинфекции.

Колипротейный

Применяется при комбинированных инфекциях, а именно: энтеропатогенной кишечной палочки, протеев, синегнойной палочки, стрептококков и стафилококков.

Сальмонеллезный

Бактериофаг против сальмонеллы.

Синегнойный

Действует эффективно против синегнойной палочки.

Коли

Действует против кишечной палочки. Существует колипротейный бактериофаг, эффективный против протеев.

Считается, что большей эффективностью обладают бактериофаги, действующие против одной инфекции. Медикаменты, сочетающие в себе несколько типов вирусов, помогают гораздо в меньшей степени. Бактериофаги выпускаются как в жидкой форме, так и таблетками. Если речь идет о лечении детей, то предпочтительной является жидкая форма выпуска.

Лечение бактериофагами

Назначение медикамента должен осуществлять только врач исключительно после анализов на выявление конкретной инфекции. Самостоятельное применение в домашних условиях может быть неэффективным, поскольку без специального исследования выявить возбудителя и определить его чувствительность к фагам нельзя.

Схема лечения каждой отдельно взятой инфекции разрабатывается для клиента индивидуально. Чаще всего к этим медикаментам прибегают для терапии кишечного дисбактериоза. Курс лечения в этом случае составляет около 5 дней, но в отдельных случаях может быть продлен до 15 суток. Для большей эффективности курсы повторяют 2-3 раза.

Вот пример одного из таких курсов терапии стафилококковой инфекции:

• грудничкам до полугода – по 5 мл;
• от полугода до года – по 10 мл;
• от года до трех лет дают 15 мл;
• от трех до восьми лет – 20 мл;
• после восьми лет – 30 мл.

Грудничкам можно давать фаги тремя способами:

• перорально (в рот);
• в форме клизмы;
• каплями в нос.

В возрасте после полугода третий вариант уже невозможен, поэтому назначают либо в виде клизмы, либо перорально. При этом дозировка для клизмы в среднем в два раза больше, чем объем, предписанный для приема через рот.

В отношении детей в педиатрии существуют различные отзывы медиков относительно применения бактериофагов. Одни утверждают, что минивирусы абсолютно безопасны, поэтому пока по старинке фаги назначают и младенцам.

В 2016 году появилась обновленная информация. Главный детский гастроэнтеролог Захарова И.Н. заявила о том, что терапия бактериофагами может привести к раку. Вирусы встраиваются в генную систему организма и могут разрушить ее.

Насколько справедливо такое утверждение, сложно сказать, но статус заявителя говорит о многом. Бактериофаги до конца еще не изучены, и применяться для терапии они стали сравнительно недавно. Длительных наблюдений за их действием на отдельные поколения пока нет.

Дорогие читатели, мы рассмотрели с вами действие бактериофагов на инфекции и организм человека. Если вам понравилась статья, рекомендуйте ее своим знакомым в соц. сетях. Информация дана для ознакомления.

Фаги атакуют
Отечественная история производства и применения бактериофагов

В нашей стране бактериофаги для нужд медицины производятся и применяются уже почти 80 лет: еще во время Великой Отечественной войны с их помощью удалось спасти жизнь тысячам раненых и предотвратить эпидемию холеры в осажденном Сталинграде перед знаменитой Сталинградской битвой. Появление и широкое распространение антибиотиков практически свело «на нет» производство бактериофагов в мире, поэтому в течение десятилетий СССР оставался единственной страной, где технологии производства фаговых препаратов не только продолжали развиваться, но были поставлены на промышленную основу.

И сегодня Россия остается мировым лидером по выпуску и терапевтическому применению этих эффективных и безопасных антибактериальных средств

Благодаря сотрудничеству двух великих ученых-микробиологов – француза Феликса д’ Эрелля и грузина Георгия Элиавы – в СССР в 1920-х гг. был создан первый и единственный в мире научно-исследовательский центр бактериофагологии. Несмотря на репрессии, в результате которых его первый директор Г. Г. Элиава был расстрелян, а часть сотрудников отправлены в ссылку, тбилисский Институт бактериофагов выстоял и продолжил свою работу, став ведущим мировым центром терапевтических исследований и производства этих бактериальных «киллеров».

Бактериофаги советского производства были впервые массово использованы в экстренных ситуациях, вызванных вспышками бактериальных инфекций в конце 1930-х гг. Так, в 1938 г. в нескольких районах Афганистана, граничащих с территорией СССР, разразилась эпидемия холеры. Чтобы предупредить распространение этого тяжелейшего бактериального заболевания, было решено использовать на пограничных территориях холерный бактериофаг. Фаговый препарат давали местному населению, добавляли в колодцы и водоемы. В итоге на советской территории не было зарегистрировано ни одного случая заболевания холерой.

В середине прошлого века биологическая наука сделала революционный шаг вперед, установив молекулярные основы функционирования живых систем. Огромную роль в успешных исследованиях, которые привели к определению химической природы наследственных молекул, расшифровке генетического кода и созданию технологий манипуляций генами, сыграли бактериофаги, открытые еще в начале прошлого столетия. На сегодняшний день эти бактериальные вирусы освоили много полезных для человека «профессий»: их используют не только как безопасные антибактериальные препараты, но и как дезинфектанты и даже в качестве основы для создания электронных наноустройств.

Когда в 1930-х гг. группа ученых занялась проблемами функционирования живых систем, то в поиске простейших моделей они обратили внимание на бактериофаги - вирусы бактерий. Ведь среди биологических объектов нет ничего проще, чем бактериофаги, к тому же их можно легко и быстро выращивать и анализировать, а вирусные генетические программы невелики.

Фаг - это минимального размера природная структура , содержащая плотно упакованную генетическую программу (ДНК или РНК), в которой нет ничего лишнего. Эта программа заключена в белковую оболочку, снабженную минимальным набором устройств для ее доставки внутрь бактериальной клетки. Бактериофаги не могут размножаться сами по себе, и в этом смысле их нельзя считать полноценными живыми объектами. Их гены начинают работать только в бактерии, используя имеющиеся в бактериальной клетке биосинтетические системы и запасы молекул, необходимых для синтеза. Однако генетические программы этих вирусов принципиально не отличаются от программ более сложных организмов, поэтому эксперименты с бактериофагами позволили установить основополагающие принципы устройства и работы генома.

В дальнейшем эти знания и разработанные в ходе исследований методы стали фундаментом для развития биологической и медицинской науки, а также широкого спектра биотехнологических приложений.

Борцы с патогенами

Первые попытки использовать бактериофаги для лечения инфекционных заболеваний были предприняты практически сразу после их открытия, однако недостаток знаний и несовершенные биотехнологии того времени не позволили достичь полного успеха. Тем не менее дальнейшая клиническая практика показала принципиальную возможность успешного применения бактериофагов при инфекционных заболеваниях желудочно-кишечного тракта, мочеполовой системы, при острых гнойно-септических состояниях больных, для лечения хирургических инфекций и т. д.

По сравнению с антибиотиками бактериофаги имеют ряд преимуществ : они не вызывают побочных эффектов, к тому же строго специфичны для определенных видов бактерий, поэтому при их использовании не нарушается нормальный микробиом человека. Однако такая высокая избирательность создает и проблемы: чтобы успешно лечить пациента, нужно точно знать инфекционный агент и подбирать бактериофаг индивидуально.

Фаги можно использовать и профилактически. Так, Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского разработал профилактический продукт «ФУДФАГ» на основе коктейля из бактериофагов, снижающий риск заражения острыми кишечными инфекциями. Клинические исследования показали, что недельный прием препарата позволяет избавиться от гемолизирующей кишечной палочки и других патогенных и условно-патогенных бактерий, вызывающих дисбактериоз кишечника.

Бактериофагами лечат инфекционные болезни не только людей, но и домашних и сельскохозяйственных животных: мастит у коров, колибактериоз и эшерихиоз у телят и свиней, сальмонеллез у кур... Особенно удобно применять фаговые препараты в случае аквакультуры - для лечения промышленно выращиваемых рыб и креветок, так как в воде они долго сохраняются. Бактериофаги помогают защитить и растения , хотя применение фаговых технологий в этом случае затруднено из-за воздействия природных факторов, таких как солнечный свет и дождь, губительных для вирусов.

Фаги могут сыграть большую роль в поддержании микробиологической безопасности продуктов питания, так как применение антибиотиков и химических агентов в пищевой отрасли не решает эту проблему, одновременно снижая уровень экологической чистоты продукции. О серьезности самой проблемы говорят статистические данные: например, в США и России ежегодно регистрируется до 40 тыс. заболевших сальмонеллезом, из которых 1% умирает. Распространение этой инфекции в значительной степени связано с выращиванием, переработкой и потреблением различных видов птицы, и попытки применить для борьбы с ней бактериофаги дали многообещающие результаты.

Так, американская компания Intralytix производит фаговые препараты для борьбы с листериозом, сальмонеллезом и бактериальным загрязнением кишечной палочкой. Они разрешены к применению как добавки, предотвращающие размножение бактерий на продуктах питания - их распыляют на продукты из мяса и домашней птицы, а также на овощи и фрукты. Эксперименты показали, что коктейль из бактериофагов может быть успешно применен и при транспортировке и реализации живой прудовой рыбы для снижения бактериального загрязнения не только воды, но и самой рыбы.

Очевидным применением бактериофагов является дезинфекция , то есть уничтожение бактерий в тех местах, где их не должно быть: в больницах, на пищевых производствах и т. п. Для этой цели британская компания Fixed-Phage разработала метод фиксации фаговых препаратов на поверхностях, обеспечивающий сохранение биологической активности фагов до трех лет.

Бактериофаги - «дрозофилы» молекулярной биологии

В 1946 г. на 11-м симпозиуме в знаменитой американской лаборатории в Колд Спринг Харборе, была провозглашена теория «один ген - один фермент». Бактериолог А. Херши и «бывший» физик, молекулярный биолог М. Дельбрюк доложили об обмене генетическими признаками между различными фагами при одновременном заражении ими клеток кишечной палочки. Это открытие, сделанное в то время, когда физический носитель гена еще не был известен, свидетельствовало, что явление «рекомбинации» - перемешивания генетических признаков, свойственно не только высшим организмам, но и вирусам. Обнаружение этого феномена в дальнейшем дало возможность детально исследовать молекулярные механизмы репликации. Позднее эксперименты с бактериофагами позволили установить принципы устройства и работы генетических программ.

В 1952 г. А. Херши и М. Чейз экспериментально доказали, что наследственная информация бактериофага Т2 закодирована не в белках, как считали многие ученые, а в молекулах ДНК (Hershey & Chase, 1952). Исследователи проследили за процессом воспроизводства в двух группах бактериофагов, одна из которых несла меченные радиоактивной меткой белки, а другая - молекулы ДНК. После инфицирования бактерий такими фагами оказалось, что в зараженную клетку передается только вирусная ДНК, что и послужило доказательством ее роли в хранении и передаче наследственной информации.

В том же году американские генетики Д. Ледерберг и Н. Циндлер в эксперименте с участием двух штаммов сальмонелл и бактериофага Р22 установили, что бактериофаг способен в процессе размножения включать в себя фрагменты ДНК бактерии-хозяина и передавать их другим бактериям при заражении (Zinder & Lederberg, 1952). Это явление переноса генов от бактерии-донора к реципиенту было названо «трансдукцией». Результаты эксперимента стали очередным подтверждением роли ДНК в передаче наследственной информации.

В 1969 г. А. Херши, М. Дельбрюк и их коллега С. Луриа стали Нобелевскими лауреатами «за открытия, касающиеся механизма репликации и генетической структуры вирусов».

В 1972 г. Р. Берд с коллегами при изучении процесса репликации (копировании клеточной информации) ДНК кишечной палочки использовали бактериофаги в качестве зондов, способных встраиваться в геном бактериальной клетки, и обнаружили, что процесс репликации идет в двух направлениях вдоль хромосомы (Стент, 1974).

Семь дней творения

Современные методы синтетической биологии позволяют не только вносить различные модификации в фаговые геномы, но и создавать полностью искусственные активные фаги. Технологически это несложно, нужно только синтезировать фаговый геном и ввести его в бактериальную клетку, а там он уже сам запустит все процессы, необходимые для синтеза белков и сборки новых фаговых частиц. В современных лабораториях на эту работу уйдет всего несколько дней.

Генетические модификации применяют, чтобы изменить специфичность фагов и повысить эффективность их терапевтического действия. Для этого наиболее агрессивные фаги снабжают узнающими структурами, связывающими их с целевыми бактериями. Также в вирусные геномы дополнительно встраивают гены, кодирующие токсические для бактерий белки, нарушающие метаболизм, - такие фаги более смертоносны для бактерий.

Бактерии имеют несколько механизмов защиты от антибиотиков и бактериофагов , один из которых - разрушение вирусных геномов ферментами рестрикции , действующими на определенные нуклеотидные последовательности. Для увеличения терапевтической активности фагов можно за счет вырожденности генетического кода так «переформатировать» последовательности их генов, чтобы минимизировать число нуклеотидных последовательностей, «чувствительных» к ферментам, одновременно сохранив их кодирующие свойства.

Универсальный способ защиты бактерий от всех внешних воздействий - так называемые биофильмы , пленки из ДНК, полисахаридов и белков, которые бактерии создают совместными усилиями и куда не проникают ни антибиотики, ни терапевтические белки. Такие биопленки - головная боль врачей, так как они способствуют разрушению зубной эмали, образуются на поверхности имплантов, катетеров, искусственных суставов, а также в дыхательных путях, на поверхности кожи и т. п. Для борьбы с биофильмами были сконструированы особые бактериофаги, содержащие ген, кодирующий специальный литический фермент, разрушающий бактериальные полимеры.

Ферменты «от бактериофага»

Большое число ферментов, сегодня широко использующихся в молекулярной биологии и генетической инженерии, были открыты в результате исследований бактериофагов.

Одним из таких примеров являются ферменты рестриктазы - группа бактериальных нуклеаз, расщепляющих ДНК. Еще в начале 1950-х гг. было обнаружено, что бактериофаги, выделенные из клеток одного штамма бактерий, зачастую плохо размножаются в близкородственном штамме. Обнаружение этого феномена означало, что у бактерий есть система подавления размножения вирусов (Luria & Human, 1952). В результате была открыта ферментативная система рестрикции-модификации, с помощью которой бактерии разрушали попавшую в клетку чужеродную ДНК. Выделение рестриктаз (эндонуклеаз рестрикции) дало в руки молекулярных биологов бесценный инструмент, позволивший манипулировать ДНК: встраивать одни последовательности в другие или вырезать необходимые фрагменты цепи, что в итоге привело к разработке технологии создания рекомбинантной ДНК.

Еще один широко используемый в молекулярной биологии фермент - ДНК-лигаза бактериофага Т4, которая «сшивает» «липкие» и «тупые» концы двуцепочечных молекул ДНК и РНК. А недавно появились генно-модифицированные варианты этого фермента с большей активностью.

От бактериофагов ведут свое происхождение и большинство используемых в лабораторной практике РНК-лигаз, которые «сшивают» одноцепочечные молекулы РНК и ДНК. В природе они в основном служат для починки сломанных молекул РНК. Исследователи наиболее часто используют РНК-лигазу бактериофага Т4, с помощью которой можно «пришить» одноцепочечные полинуклеотиды к РНК-молекулам, чтобы пометить их. Такой прием применяется для анализа структуры РНК, поиска мест связывания РНК с белками, олигонуклеотидного синтеза и т. д. Недавно среди рутинно используемых ферментов появились термостабильные РНК-лигазы, выделенные из бактериофагов rm378 и TS2126 (Nordberg Karlsson, et al., 2010; Hjorleifsdottir, 2014).

Из бактериофагов получены и некоторые из еще одной группы чрезвычайно важных ферментов - полимераз. Например, очень «точная» ДНК-полимераза бактериофага Т7, которая нашла применение в различных областях молекулярной биологии, таких как сайт-направленный мутагенез, но в основном ее используют для определения первичной структуры ДНК.

Химически модифицированная ДНК-полимераза фага Т7 была предложена как идеальный инструмент для секвенирования ДНК еще в 1987 г. (Tabor & Richardson, 1987). Модификация этой полимеразы увеличила эффективность ее работы в несколько раз: скорость полимеризации ДНК при этом достигает более 300 нуклеотидов в секунду, поэтому ее можно использовать для амплификации больших фрагментов ДНК. Этот фермент стал предшественником секвеназы - генно-инженерного фермента, оптимизированного для секвенирования ДНК в реакции Сэнгера. Секвеназа отличается высокой эффективностью и способностью включать в последовательность ДНК нуклеотидные аналоги, используемые для улучшения результатов секвенирования.

Происхождение от бактериофагов ведут и используемые в молекулярной биологии основные РНК-полимеразы (ДНК-зависимые РНК-полимеразы) - ферменты, которые катализируют процесс транскрипции (считывание РНК-копий с матрицы ДНК). К ним относятся SP6-, T7- и Т3-РНК-полимеразы, названные в честь соответствующих бактериофагов SP6, Т7 и Т3. Все эти ферменты используются для синтеза «в пробирке» антисмысловых РНК-транскриптов, меченых РНК-зондов и т. д.

Первым полностью секвенированным ДНК-геномом стал геном фага φ174 длиной свыше 5 тыс. нуклеотидов (Sanger et al., 1977). Эту расшифровку осуществила группа английского биохимика Ф. Сэнгера, создателя известного одноименного метода секвенирования ДНК.

Полинуклеотидкиназы катализируют перенос фосфатной группы от молекулы АТФ к 5′-концу молекулы нуклеиновой кислоты, обмен 5′-фосфатных групп или фосфорилирование 3′-концов мононуклеотидов. В лабораторной практике наибольшее распространение получила полинуклеотидкиназа бактериофага Т4. Она обычно используется в экспериментах для мечения ДНК радиоактивным изотопом фосфора. Полинуклеотидкиназа также используется для поиска сайтов рестрикции, ДНК и РНК дактилоскопии, синтеза субстратов для ДНК или РНК-лигаз.

В молекулярно-биологических экспериментах также находят широкое применение такие ферменты бактериофагов, как полинуклеотидкиназа фага Т4, обычно используемая для мечения ДНК радиоактивным изотопом фосфора, ДНК и РНК дактилоскопии и др., а также ферменты, расщепляющие ДНК, которые используются для получения одноцепочечных ДНК-матриц для секвенирования и анализа нуклеотидного полиморфизма.

Методами синтетической биологии удалось разработать и бактериофаги, вооруженные самым изощренным оружием, которое бактерии используют против самих фагов. Речь идет о бактериальных системах CRISPR-Cas , представляющих собой комплекс фермента нуклеазы, расщепляющей ДНК, и РНК-последовательности, направляющей действие этого фермента на определенный фрагмент вирусного генома. В качестве «указателя» служит кусочек фаговой ДНК, который бактерия сохраняет «на память» в специальном гене. При обнаружении внутри бактерии аналогичного фрагмента этот белково-нуклеотидный комплекс разрушает его.

Разобравшись с механизмом работы систем CRISPR-Cas, исследователи попробовали снабдить подобным «оружием» и самих фагов, для чего в их геном ввели комплекс генов, кодирующий нуклеазу и адресующие последовательности РНК, комплементарные специфическим участкам генома бактерий. «Мишенью» могут выступать гены, ответственные за множественную лекарственную устойчивость. Эксперименты увенчались полным успехом - такие фаги с большой эффективностью поражали бактерии, на которые были «настроены».

Фаговые антибиотики

В терапевтических целях фаги необязательно использовать напрямую. За миллионы лет эволюции бактериофаги разработали арсенал специфических белков - инструментов для распознавания целевых микроорганизмов и манипуляций с биополимерами жертвы, на основе которых можно создавать противобактериальные препараты. Наиболее перспективными белками такого типа являются ферменты эндолизины, которые фаги используют для разрушения клеточной стенки при выходе из бактерии. Сами по себе эти вещества являются мощными антибактериальными средствами, нетоксичными для человека. Эффективность и направленность их действия можно повысить, изменив в них адресующие структуры - белки, специфически связывающиеся с определенными бактериями.

Большинство бактерий делятся по устройству клеточной стенки на грамположительные, мембрана которых покрыта очень толстым слоем пептидогликанов, и грамотрицательные, у которых слой пептидогликана расположен между двумя мембранами. Использование природных эндолизинов особенно эффективно в случае грамположительных бактерий (стафилококков, стрептококков и др.), поскольку пептидогликановый слой у них расположен снаружи. Грамотрицательные бактерии (синегнойная палочка, сальмонеллы, кишечная палочка и др.) являются менее доступной мишенью, поскольку ферменту, чтобы добраться до внутреннего пептидогликанового слоя, необходимо проникнуть сквозь внешнюю бактериальную мембрану.

Для преодоления этой проблемы были созданы так называемые артилизины - модифицированные варианты природных эндолизинов, содержащие поликатионные или амфипатические пептиды, которые дестабилизируют внешнюю мембрану и обеспечивают доставку эндолизина непосредственно к пептидогликановому слою. Артилизины обладают высокой бактерицидной активностью и уже показали свою эффективность при лечении отитов у собак (Briers et al., 2014).

Примером модифицированного эндолизина, избирательно действующего на определенные бактерии, является препарат P128 канадской компании GangaGen Inc . Он представляет собой биологически активный фрагмент эндолизина, соединенный с лизостафином - адресующей белковой молекулой, которая связывается с поверхностью клеток стафилококков. Полученный химерный белок обладает высокой активностью против разных штаммов стафилококка, в том числе обладающих множественной лекарственной устойчивостью.

«Счетчики» бактерий

Бактериофаги служат не только разносторонним терапевтическим и «дезинфицирующим» средством, но и удобным и точным аналитическим инструментом микробиолога. К примеру, благодаря своей высокой специфичности они являются природными аналитическими реагентами для выявления бактерий определенного вида и штамма.

В простейшем варианте такого исследования в чашку Петри с питательной средой, засеянную бактериальной культурой, добавляют по капле различные диагностические бактериофаги. Если бактерия окажется чувствительной к фагу, то на этом месте бактериального «газона» образуется «бляшка» - прозрачный участок с убитыми и лизированными бактериальными клетками.

Анализируя размножение фагов в присутствии целевых бактерий, можно количественно определить численность последних. Так как количество фаговых частиц в растворе возрастет пропорционально числу содержавшихся в нем бактериальных клеток, то для оценки численности бактерий достаточно определить титр бактериофага.

Специфичность и чувствительность такой аналитической реакции достаточно высока, а сами процедуры просты в исполнении и не требуют сложного оборудования. Важно, что диагностические системы, основанные на бактериофагах, сигнализируют о наличии именно живого патогена, тогда как другие методы, такие как ПЦР и иммуноаналитические, свидетельствуют лишь о наличии биополимеров, принадлежащих этой бактерии. Такого типа диагностические методы особенно удобны для использования в экологических исследованиях, а также в пищевой индустрии и сельском хозяйстве.

Сейчас для выявления и количественного определения разных штаммов микроорганизмов применяют специальные референсные виды фагов. Очень быстрые, работающие практически в режиме реального времени аналитические системы могут быть созданы на основе генетически модифицированных бактериофагов, которые при попадании в бактериальную клетку запускают в ней синтез репортерных флуоресцирующих (или способных к люминесценции) белков, таких как люцифераза . При добавлении к подобной среде необходимых субстратов в ней будет появляться люминесцентный сигнал, величина которого соответствует содержанию бактерий в образце. Такие «меченные светом» фаги были разработаны для детекции опасных патогенов - возбудителей чумы, сибирской язвы, туберкулеза, а также инфекций растений.

Вероятно, с помощью модифицированных фагов удастся решить и давнюю задачу глобальной важности - разработать дешевые и быстрые методы детекции возбудителей туберкулеза на ранней стадии заболевания. Задача эта очень сложна, поскольку микобактерии, вызывающие туберкулез, отличаются крайне медленным ростом при культивировании в лабораторных условиях. Поэтому диагностика заболевания традиционными методами может затягиваться на срок до нескольких недель.

Фаговая технология позволяет упростить эту задачу. Суть ее в том, что к образцам анализируемой крови добавляют бактериофаг D29, способный поражать широкий спектр микобактерий. Затем бактериофаги отделяют, и образец перемешивают с быстрорастущей непатогенной культурой микобактерий, также чувствительной к этому бактериофагу. Если в крови первоначально имелись микобактерии, которые были инфицированы фагами, то в новой культуре будет также наблюдаться наработка бактериофага. Таким образом можно выявить единичные клетки микобактерий, а сам процесс диагностики с 2–3 недель сокращается до 2–5 дней (Swift & Rees, 2016).

Фаговый дисплей

В наши дни бактериофаги широко применяются также в качестве простых систем для наработки белков с заданными свойствами. Речь идет о разработанной в 1980-х гг. крайне эффективной молекулярно-селекционной методике - фаговом дисплее . Этот термин был предложен американцем Дж. Смитом, который доказал, что на основе бактериофагов кишечной палочки можно создать жизнеспособный модифицированный вирус, несущий на своей поверхности чужеродный белок. Для этого в фаговый геном внедряется соответствующий ген, который сливается с геном, кодирующим один из поверхностных вирусных белков. Такие модифицированные бактериофаги можно выделить из смеси с фагами дикого типа благодаря способности «чужого» белка связываться со специфичными антителами (Smith, 1985).

Из экспериментов Смита последовало два важных вывода: во-первых, используя технологию рекомбинантных ДНК, можно создавать огромные по разнообразию популяции численностью 10 6 –10 14 фаговых частиц, каждая из которых несет на своей поверхности разные варианты белков. Такие популяции назвали комбинаторные фаговые библиотеки . Во-вторых, выделив из популяции конкретный фаг (например, обладающий способностью связываться с определенным белком или органической молекулой), можно этот фаг размножить в бактериальных клетках и получить неограниченное число потомков с заданными свойствами.

С помощью фагового дисплея сегодня производят белки, которые могут избирательно связываться с терапевтическими мишенями, например, экспонированные на поверхности фага М13, способные узнавать и взаимодействовать с опухолевыми клетками. Роль этих белков в фаговой частице заключается в «упаковке» нуклеиновой кислоты, поэтому они хорошо подходят для создания препаратов генотерапии, только в этом случае они формируют частицу уже с терапевтической нуклеиновой кислотой.

На сегодня можно выделить два основных направления применения фагового дисплея. Технология на основе пептидов используется для исследования рецепторов и картирования сайтов связывания антител, создания иммуногенов и нановакцин, а также картирования сайтов связывания субстратов у белков-ферментов. Технология на основе белков и белковых доменов - для отбора антител с заданными свойствами, изучения белок-лигандных взаимодействий, скрининга экспрессируемых фрагментов комплементарной ДНК и направленных модификаций белков.

С помощью фагового дисплея можно вносить узнающие группировки во все виды поверхностных вирусных белков, а также в основной белок, формирующий тело бактериофага. Вводя в поверхностные белки пептиды с заданными свойствами, можно получить целый спектр ценных биотехнологических продуктов. Например, если этот пептид будет имитировать белок опасного вируса или бактерии, узнаваемый иммунной системой, то такой модифицированный бактериофаг представляет собой вакцину, которую можно просто, быстро и безопасно наработать.

Если же концевой поверхностный белок бактериофага «адресовать» на раковые клетки, а к другому поверхностному белку присоединить репортерные группы (например, флуоресцирующие или магнитные), то получится средство для обнаружения опухолей. А если к частице присоединить еще и цитотоксический препарат (а современная биоорганическая химия позволяет легко это сделать), то получится лекарство, направленно действующее на раковые клетки.

Одним из важных применений метода фагового дисплея белков является создание фаговых библиотек рекомбинантных антител, где антигенсвязывающие фрагменты иммуноглобулинов расположены на поверхности фаговых частиц fd или М13. Особый интерес представляют библиотеки антител человека, поскольку такие антитела могут быть использованы в терапии без ограничения. В последние годы только на фармацевтическом рынке США продается около полутора десятка терапевтических антител, сконструированных с использованием этого метода.

«Промышленные» фаги

Методология фагового дисплея нашла себе и совершенно неожиданное применение. Ведь бактериофаги в первую очередь являются наноразмерными частицами определенной структуры, на поверхности которых располагаются белки, которые с помощью фагового дисплея можно «снабдить» свойствами специфически связываться с нужными молекулами. Такие наночастицы открывают широчайшие возможности для создания материалов с заданной архитектурой и «умных» молекулярных наноустройств, при этом технологии их производства будут экологически чистыми.

Так как вирус представляет собой достаточно жесткую конструкцию с определенным соотношением размерностей, это обстоятельство позволяет использовать его для получения пористых наноструктур с известной площадью поверхности и нужным распределением пор в структуре. Как известно, именно площадь поверхности катализатора является критическим параметром, определяющим его эффективность. А существующие на сегодня технологии формирования на поверхности бактериофагов тончайшего слоя металлов и их оксидов позволяют получать катализаторы с чрезвычайно развитой регулярной поверхностью заданной размерности. (Lee et al., 2012).

Исследователь из Массачусетского технологического института А. Бельхер использовала бактериофаг M13 как шаблон для роста наночастиц и нанопроводов родия и никеля на поверхности оксида церия. Полученные наночастицы катализатора способствуют конвертации этанола в водород, таким образом, этот катализатор может оказаться весьма полезным для модернизации существующих и создания новых водородных топливных ячеек. Катализатор, выращенный на шаблоне вируса, отличается от аналогичного по составу «обычного» катализатора более высокой стабильностью, он менее подвержен старению и дезактивации поверхности (Nam et al. , 2012).

Путем покрытия нитчатых фагов золотом и двуокисью индия были получены электрохромные материалы - пористые нанопленки, меняющие цвет при изменении электрического поля, способные реагировать на изменение электрического поля в полтора раза быстрее известных аналогов. Подобного рода материалы перспективны для создания энергосберегающих ультратонких экранных устройств (Nam et al., 2012).

В Массачусетском технологическом институте бактериофаги стали основой для производства очень мощных и чрезвычайно компактных электрических батарей. Для этого использовали живые, генетически модифицированные фаги М13, неопасные для человека и способные присоединять к поверхности ионы различных металлов. В результате самосборки этих вирусов были получены структуры заданной конфигурации, которые при покрытии металлом сформировали достаточно длинные нанопровода, ставшие основой анода и катода. При самоформировании материала анода использовался вирус, способный присоединять золото и оксид кобальта, для катода - способный присоединять фосфат железа и серебро. Последний фаг также обладал способностью за счет молекулярного опознания «подхватывать» концы углеродной нанотрубки, что необходимо для обеспечения эффективного переноса электронов.

На основе комплексов бактериофага М13, двуокиси титана и одностенных углеродных нанотрубок были также созданы материалы для солнечных батарей (Dang et al., 2011).

Последние годы ознаменовались широкими исследованиями бактериофагов, которые находят себе все новые применения не только в терапии, но и в био- и нанотехнологиях. Их очевидным практическим результатом должно стать возникновение нового мощного направления персонализированной медицины, а также создание целого спектра технологий в пищевой промышленности, ветеринарии, сельском хозяйстве и в производстве современных материалов. Мы ждем, что второе столетие исследований бактериофагов принесет не меньше открытий, чем первое.

Литература
1. Бактериофаги: биология и применение / Ред.: Э. Каттер, А. Сулаквелидзе. М.: Научный мир. 2012.
2. Стент Г., Кэлиндар Р. Молекулярная генетика. М.: Мир. 1974. 614 с.
3. Тикунова Н. В., Морозова В. В. Фаговый дисплей на основе нитчатых бактериофагов: применение для отбора рекомбинантных антител // Acta Naturae . 2009. № 3. C. 6–15.
4. Mc Grath S., van Sinderen D. Bacteriophage: Genetics and Molecular Biology. Horizon Scientific Press, 2007.

Константин Мирошников

Феликс Хьюберт Д’Эрель (Fйlix Hubert d’Hйrelle) французский и канадский микробиолог. Открыл бактериофаги. Детально описал бактериофагию. Предложил использовать бактериофаги для лечения инфекционных заболеваний.

Д’Эрель родился в Монреале, Квебеке (Канада) в 1873 году в семье французских эмигрантов. После смерти отца семья переехала в Париж, где Д’Эрель закончил среднюю школу. Другого образования он не получил, и всю жизнь занимался самообразованием. Д’Эрелль всегда был охвачен страстью к путешествиям: в 16 лет он объездил пол-Европы на велосипеде, в 17 путешествовал по Южной Америке. Эта склонность к перемене мест владела ученым до конца дней - он работал по всему миру. В возрасте 24 лет Д’Эрелль с семьей переехал в Канаду. Для заработка он изучал процессы изготовления шнапса из кленового сиропа, а в свободное время устроил у себя дома лабораторию и занимался микробиологией. Одно время он работал как санитар в геологической экспедиции в Лабрадоре, не имея никакой медицинской степени или реального опыта. В попытке решить финансовые проблемы он уехал с семьей в Гватемалу, получив должность бактериолога при столичной больнице. Там, помимо основной деятельности, Д’Эрелль изучал вопрос о получении виски из бананов. Этот опыт помог ему получить новую работу: мексиканское правительство пригласило его заняться темой «Шнапс из агавы». Мексиканцы послали Д’Эрелля в Париж, наблюдать за изготовлением станков для шнапсового завода, но все свободное время он проводил в крупнейшем научном центре - Институте Пастера, работая волонтером, без оплаты. Он так увлекся, что бросил агавы и шнапс, и в 1911 г перевез семью из Мексики в Париж. Перед этим, в этом же году, он еще раз съездил в Мексику, где выделил микроорганизмы из трупов саранчи, массовая гибель которой от неизвестной болезни наблюдалась на полуострове Юкатан.

Выделенный организм, названный Coccobacillus acridiorum, Д Эрелль размножил и испытал против саранчи в Гватемале, Аргентине и Тунисе. То было не очень удачное, но первое в истории использование биологического способа борьбы с вредителями сельскохозяйственных культур. Эта работа впервые привлекла внимание к Д’Эреллю в ученом сообществе. В 1912 и 1913 году он снова пытался использовать Coccobacillus acridiorum для борьбы с саранчой в Аргентине. После первой мировой войны Д’Эрелль занялся темой, которая сделала его знаменитым. Изучая бактерии, вызывающие дизентерию, он обнаружил инфекционный агент, который вызывал их гибель - лизис. Д’Эреллю удалось наладить его размножение: бактерии, зараженные им, погибали, а количество агента увеличивалось. Д’Эрелль предложил для агента название - «бактериофаг» - пожиратель бактерий.

Д’Эреллю принадлежит также идея использовать бактериофаги для лечения бактериальных заболеваний. В 1919 году Д’Эрелль успешно вылечил фагом первого пациента. В то время еще не было антибиотиков, так что любая попытка найти лекарство от бактерий имела огромное значение. Начался настоящий бум фаговой терапии. В 1920 году Д’Эрелль ездил в Индокитай с целью исследовать холеру и чуму. В это время он все еще работал в Институте Пастера в качестве волонтера. В 1921 году ему удалось издать монографию о бактериофагах. Известность его росла и в 1925 году он, наконец, получил звание почетного доктора Лейденского университета и медаль Левенгука. Однако в Лейденском университете ему предложили лишь временную позицию, и когда срок ее истек, Д’Эрелль уехал бороться с чумой и холерой в Египет. В Египте Д’Эрелль с успехом использовал фаги, которые он собрал у зараженных чумой крыс во время посещения им в 1920 году Индокитая, на зараженных чумой людях. Основываясь на его результатах, Великобритания начала обширную кампанию против чумы.

Затем Д’Эрелль выделил и использовал бактериофаги для лечения холеры в Индии. В 1928 году Д’Эрелль становится профессором в Йельском университете в Нью-Хейвене (США). Тем временем европейские и американские фармацевтические компании наладили производство бактериофагов в медицинских целях и обещали всем фантастические эффекты. Противодействуя им, Д’Эрелль создал французскую компанию, производящую фаги. Однако все компании столкнулись с технологическими проблемами производства. Кроме того, неправильные диагнозы часто приводили к использованию неправильного вида фагов. Все это привело к тому, что научное сообщество отвернулось от Д’Эрелля. К тому же Д’Эрелль имел непростой характер и нажил себе много врагов.

В сложившейся ситуации он принял приглашение И. В. Сталина, в 1934 году приехал в Советский Союз и обосновался в Тифлисе, у знакомого ему по пастеровскому институту грузинского ученого Г. Элиава. В Тбилиси он участвовал в создании НИИ бактериофага (впоследствии НИИ вакцин и сывороток). Д’Эрелль уже начал строить себе дом в Тбилиси, но в 1939 году Г. Элиава был репрессирован, и Д’Эрелль, который, по практике того времени должен был быть неминуемо расстрелян в числе друзей Г. Элиава, чудом успел уехать во Францию и спасти семью.

Тем временем начался век антибиотиков, и фаговая терапия на Западе была почти забыта: фаги гораздо дороже и сложнее в производстве чем, например, пенициллин. Лишь в Советском Союзе, особенно в Грузии велись работы по культуре фага - вплоть до наших дней. Д’Эрелль пережил немецкую оккупацию во Франции и умер в Париже 22 февраля 1949 года, практически забытый как ученый. Но имя Д’Эрелля упомянуто в особом списке людей, кому следовало бы присудить Нобелевскую премию. А интерес к фаговой терапии в последнее время вновь возрастает в связи проблемой устойчивости микроорганизмов к антибиотикам.

В конце ХХ века стало ясно, что бактерии безусловно доминируют в биосфере Земли, составляя более 90% ее биомассы. У каждого вида имеется множество специализированных типов вирусов. По предварительным оценкам, число видов бактериофагов составляет около 1015. Чтобы понять масштаб этой цифры, можно сказать, что если каждый человек на Земле будет каждый день открывать по одному новому бактериофагу, то на описание всех их понадобится 30 лет.

Бактериофаг

Таким образом, бактериофаги — самые малоизученные существа в нашей биосфере. Большинство известных сегодня бактериофагов принадлежит к отряду Caudovirales — хвостатые вирусы. Их частицы имеют размер от 50 до 200 нм. Хвост разной длины и формы обеспечивает присоединение вируса к поверхности бактерии-хозяина, головка (капсид) служит хранилищем для генома. Геномная ДНК кодирует структурные белки, формирующие «тело» бактериофага, и белки, которые обеспечивают размножение фага внутри клетки в процессе инфекции.

Можно сказать, что бактериофаг — это природный высокотехнологичный нанообъект. Например, хвосты фагов представляют собой «молекулярный шприц», который протыкает стенку бактерии и, сокращаясь, впрыскивает свою ДНК внутрь клетки. С этого момента начинается инфекционный цикл. Его дальнейшие этапы состоят из переключения механизмов жизнедеятельности бактерии на обслуживание бактериофага, размножение его генома, построение множества копий вирусных оболочек, упаковки в них ДНК вируса и, наконец, разрушение (лизис) хозяйской клетки.

Бактериофаг сокращаясь впрыскивается свою ДНК в бактерию

Помимо постоянного эволюционного соревнования механизмов защиты у бактерий и нападения у вирусов, причиной сложившегося равновесия можно считать и то, что бактериофаги специализировались по своему инфекционному действию. Если имеется крупная колония бактерий, где своих жертв найдут и следующие поколения фагов, то уничтожение бактерий литическими (убивающими, дословно — растворяющими) фагами идет быстро и непрерывно.

Если потенциальных жертв маловато или внешние условия не слишком подходят для эффективного размножения фагов, то преимущество получают фаги с лизогенным циклом развития. В этом случае после внедрения внутрь бактерии ДНК фага не сразу запускает механизм инфекции, а до поры до времени существует внутри клетки в пассивном состоянии, зачастую внедряясь в бактериальный геном.

В таком состоянии профага вирус может существовать долго, проходя вместе с хромосомой бактерии циклы деления клетки. И лишь когда бактерия попадает в благоприятную для размножения среду, активируется литический цикл инфекции. При этом, когда ДНК фага освобождается из бактериальной хромосомы, часто захватываются и соседние участки бактериального генома, а их содержимое в дальнейшем может перенестись в следующую бактерию, которую заразит бактериофаг. Этот процесс (трансдукция генов) считается важнейшим средством переноса информации между прокариотами — организмами без клеточных ядер.

Все эти молекулярные тонкости не были известны во втором десятилетии ХХ века, когда были открыты «невидимые инфекционные агенты, уничтожающие бактерий». Но и без электронного микроскопа, с помощью которого в конце 1940-х впервые удалось получить изображения бактериофагов, было понятно, что они способны уничтожать бактерии, в том числе и болезнетворные. Это свойство было незамедлительно востребовано медициной.

Бактериофаг

Первые попытки лечения фагами дизентерии, раневых инфекций, холеры, тифа и даже чумы были проведены достаточно аккуратно, и успех выглядел вполне убедительно. Но после начала массового выпуска и использования фаговых препаратов эйфория сменилась разочарованием. О том, что такое бактериофаги, как производить, очищать и применять их лекарственные формы, было известно еще очень мало. Достаточно сказать, что по результатам предпринятой в США в конце 1920-х годов проверки во многих промышленных фагопрепаратах собственно бактериофагов вообще не оказалось.

Проблема с антибиотиками

Вторую половину ХХ века в медицине можно назвать «эрой антибиотиков». Однако еще первооткрыватель пенициллина Александр Флеминг в своей нобелевской лекции предупреждал, что устойчивость микробов к пенициллину возникает довольно быстро. До поры до времени антибиотикоустойчивость компенсировалась разработкой новых типов противомикробных лекарств. Но с 1990-х годов стало ясно, что человечество проигрывает «гонку вооружений» против микробов.

Виновато прежде всего бесконтрольное применение антибиотиков не только в лечебных, но и в профилактических целях, причем не только в медицине, но и в сельском хозяйстве, пищевой промышленности и быту. В результате устойчивость к этим препаратам начала вырабатываться не только у болезнетворных бактерий, но и у самых обычных микроорганизмов, живущих в почве и воде, делая из них «условных патогенов».

Такие бактерии комфортно существуют в медицинских учреждениях, заселяя сантехнику, мебель, медицинскую аппаратуру, порой даже дезинфицирующие растворы. У людей с ослабленным иммунитетом, каких в больницах большинство, они вызывают тяжелейшие осложнения.

Неудивительно, что медицинское сообщество бьет тревогу. В прошедшем, 2012 году гендиректор ВОЗ Маргарет Чен выступила с заявлением, предсказывающим конец эры антибиотиков и беззащитность человечества перед инфекционными заболеваниями. Впрочем, практические возможности комбинаторной химии — основы фармакологической науки — далеко не исчерпаны. Другое дело, что разработка противомикробных средств — очень дорогой процесс, не приносящий таких прибылей, как многие другие лекарства. Так что страшилки о «супербактериях» — это скорее предостережение, побуждающее людей к поискам альтернативных решений.

На медицинской службе

Вполне логичным выглядит возрождение интереса к использованию бактериофагов — естественных врагов бактерий — для лечения инфекций. Действительно, за десятилетия «эры антибиотиков» бактериофаги активно служили науке, но не медицине, а фундаментальной молекулярной биологии. Достаточно упомянуть расшифровку «триплетов» генетического кода и процесса рекомбинации ДНК. Сейчас о бактериофагах известно достаточно, чтобы обоснованно выбирать фаги, подходящие для терапевтических целей.

Фотография, сделанная с помощью электронного микроскопа, показывает процесс закрепления бактериофагов (колифагов T1) на поверхности бактерии E. coli

Достоинств у бактериофагов как потенциальных лекарств множество. Прежде всего — это их несметное количество. Хотя изменять генетический аппарат бактериофага тоже намного проще, чем у бактерии, и тем более — у высших организмов, в этом нет необходимости. Всегда можно подобрать что-то подходящее в природе. Речь идет скорее о селекции, закреплении востребованных свойств и размножении нужных бактериофагов.

Это можно сравнить с выведением пород собак — ездовых, сторожевых, охотничьих, гончих, бойцовых, декоративных… Все они при этом остаются собаками, но оптимизированы под определенный вид действий, нужных человеку. Во-вторых, бактериофаги строго специфичны, то есть они уничтожают только определенный вид микробов, не угнетая при этом нормальную микрофлору человека.

В-третьих, когда бактериофаг находит бактерию, которую должен уничтожить, он в процессе своего жизненного цикла начинает размножаться. Таким образом, не столь острым становится вопрос дозировки. В-четвертых, бактериофаги не вызывают побочных эффектов. Все случаи аллергических реакций при использовании терапевтических бактериофагов были вызваны либо примесями, от которых препарат был недостаточно очищен, либо токсинами, выделяющимися при массовой гибели бактерий. Последнее явление, «эффект Герксхаймера», нередко наблюдается и при применении антибиотиков.

Две стороны медали

К сожалению, недостатков у медицинских бактериофагов тоже немало. Самая главная проблема проистекает из достоинства — высокой специфичности фагов. Каждый бактериофаг инфицирует строго определенный тип бактерий, даже не таксономический вид, а ряд более узких разновидностей, штаммов. Условно говоря, как если бы сторожевая собака начинала лаять только на одетых в черные плащи громил двухметрового роста, а на лезущего в дом подростка в шортах никак не реагировала.

Поэтому для нынешних фаговых препаратов нередки случаи неэффективного применения. Препарат, сделанный против определенного набора штаммов и прекрасно лечащий стрептококковую ангину в Смоленске, может оказаться бессильным против по всем признакам такой же ангины в Кемерове. Болезнь та же, вызывается тем же микробом, а штаммы стрептококка в разных регионах оказываются различными.

Для максимально эффективного применения бактериофага необходима точная диагностика патогенного микроба, вплоть до штамма. Самый распространенный сейчас метод диагностики — культуральный посев — занимает много времени и требуемой точности не дает. Быстрые методы — типирование с помощью полимеразной цепной реакции или масс-спектрометрии — внедряются медленно из-за дороговизны аппаратуры и более высоких требований к квалификации лаборантов. В идеале подбор фагов-компонентов лекарственного препарата можно было бы делать против инфекции каждого конкретного пациента, но это дорого и на практике неприемлемо.

Другой важный недостаток фагов — их биологическая природа. Кроме того, что бактериофаги для поддержания инфекционности требуют особых условий хранения и транспортировки, такой метод лечения открывает простор для множества спекуляций на тему «посторонней ДНК в человеке». И хотя известно, что бактериофаг в принципе не может заразить человеческую клетку и внедрить в нее свою ДНК, поменять общественное мнение непросто.

Из биологической природы и довольно большого, по сравнению с низкомолекулярными лекарствами (теми же антибиотиками), размера вытекает третье ограничение — проблема доставки бактериофага в организм. Если микробная инфекция развивается там, куда бактериофаг можно приложить напрямую в виде капель, спрея или клизмы, — на коже, открытых ранах, ожогах, слизистых оболочках носоглотки, ушей, глаз, толстого кишечника — то проблем не возникает.

Но если заражение происходит во внутренних органах, ситуация сложнее. Случаи успешного излечения инфекций почек или селезенки при обычном пероральном приеме препарата бактериофага известны. Но сам механизм проникновения относительно крупных (100 нм) фаговых частиц из желудка в кровоток и во внутренние органы изучен плохо и сильно разнится от пациента к пациенту. Бактериофаги бессильны и против тех микробов, которые развиваются внутри клеток, например возбудителей туберкулеза и проказы. Через стенку человеческой клетки бактериофаг пробраться не может.

Нужно отметить, что противопоставлять применение бактериофагов и антибиотиков в медицинских целях не следует. При совместном их действии наблюдается взаимное усиление противобактериального эффекта. Это позволяет, например, снизить дозы антибиотиков до значений, не вызывающих выраженных побочных эффектов. Соответственно, и механизм выработки у бактерий устойчивости к обоим компонентам комбинированного лекарства почти невозможен.

Расширение арсенала противомикробных препаратов дает больше степеней свободы в выборе методики лечения. Таким образом, научно обоснованное развитие концепции применения бактериофагов в противомикробной терапии — перспективное направление. Бактериофаги служат не столько альтернативой, сколько дополнением и усилением в борьбе с инфекциями.

Бактериофаги и иммунитет

Поскольку бактериофагов в природе несметное количество и они постоянно попадают в организм человека с водой, воздухом и пищей, то иммунитет их просто игнорирует. Существует даже гипотеза о симбиозе бактериофагов в кишечнике, регулирующем кишечную микрофлору. Добиться какой-то иммунной реакции можно лишь при длительном введении в организм больших доз фагов.

Но таким образом можно добиться аллергии на почти любые вещества. И наконец, очень важно, что бактериофаги недороги. Разработка и производство препарата, состоящего из точно подобранных бактериофагов с полностью расшифрованными геномами, культивированных по современным биотехнологическим стандартам на определенных штаммах бактерий в химически чистых средах и прошедших высокую очистку, на порядки дешевле, чем современных сложных антибиотиков.

Это позволяет быстро приспосабливать фаготерапевтические препараты к меняющимся наборам патогенных бактерий и применять бактериофаги в ветеринарии, где дорогие лекарства экономически не оправданы.

Бактериофаги (фаги) (от греч. φάγος - пожирать) - вирусы, избирательно поражающие бактериальные клетки. Чаще всего, бактериофаги размножаются внутри бактерий и вызывают их лизис.

Бактериофагия - процесс взаимодействия фагов с бактериями, заканчивающийся очень часто их разрушением (от лат. bacteriophage - пожирающий бактерии).

1896 год - открытие бактериофагов Британским бактериологом Эрнестом Ханкин.

1898 год - бактериофаги исследованы российским ученым Николаем Гамалея. В этом же году фаги стали использовать при лечении ран и различных инфекций.

1920-е годы - Феликс Д"Эрель - канадский сотрудник Института Пастера (Париж) назвал бактериофаги «бактериофагами» и охарактеризовал их: «вирусы, размножающиеся в бактериях».

1940-е годы - везде, кроме СССР разработки бактериофагов вычеркнуты из числа перспективных исследований. В СССР исследования продолжаются.

Во всем мире популярность приобретает метод применения антибиотиков.

1980-е годы Эффективность лечения антибиотиками значительно понизилась. Бактерии выработали лекарственную устойчивость.

Интерес к фаговой терапии возобновился.

Начало 2000-х годов - Гленн Моррис - сотрудник Университета Мэриленд (США) совместно с НИИ бактериофагов, микробиологии и вирусологии в Тбилиси наладил испытания фаговых препаратов для получения лицензии на их применение в США.

Июль 2007 года- бактериофаги одобрены для использования в США.

На протяжении последних нескольких лет исследования свойств бактериофагов проводятся в России, Грузии, Польше, Франции, Германии, Финляндии, Канаде, США, Великобритании, Мексике, Израиле, Индии, Австралии.

Явление бактериофагии наблюдали многие ученые. Однако до появления краткой, но яркой статьи Туорта (1915) изучением этих явлений не занимались. Английский бактериолог Туорто писал острую инфекционную болезнь стафилококков, которая вызывала значительные изменения морфологии колоний. Инфекционный агент проходил через фильтры, и его можно было пассировать от одной колонии к другой. Туорт выдвинул несколько гипотез для объяснения этого явления, в том числе и гипотезу о фильтрующемся вирусе, аналогичном патогенным вирусам растений и животных. В замечательной статье Туорта заключена сущность современного взгляда на природу бактериофага, однако эта статья в свое время не привлекла внимания ученых, а Туорт не продолжил свою работу, может быть, потому, что служил в это время в армии.

В 1917 г. канадский бактериолог Феликс Д"Эрелль. работавший в институте Пастера в Париже, независимо от Туорта сообщил в печати об открытии «бактериофага». В ряде интересных работ он описал и правильно истолковал многие факты, касающиеся действия бактериофага, а в 1921 г. опубликовал свой классический труд по этому вопросу.

Под влиянием сообщения о том, что чума свиней вызывается синергическим действием микроба и вируса, Д"Эрелль занялся поисками доказательств подобной же смешанной этиологии бациллярной дизентерии человека.

Занимаясь изучением дизентерии, Феликс Д"Эрелль задумался над вопросом: почему возбудитель этой болезни, высевающийся в ее начале в большом количестве, в конце заболевания очень часто перестает выделяться? Заподозрив здесь действие какого - то агента, Д"Эрелль решил его обнаружить. С этой целью к свежей бульонной культуре дизентерийной палочки он стал добавлять по нескольку капель фильтрата испражнений больного. После одного из таких посевов Д"Эрелль и обнаружил этот агент по его способности разрушать дизентерийные бактерии. При добавлении к мутной бульонной культуре он вызвал ее просветление, а при добавлении к культуре, засеянной на плотную среду, появлялись прозрачные (стерильные) пятна - колонии. Способность вызывать такие пятна и размножаться при повторных посевах дали основание считать его живым корпускулярным агентом. Д"Эрелль назвал его Bacteriophagum intestinale, т. е. выделенный из кишечника пожиратель бактерий. Последующие наблюдения показали, что бактериофаги распространены повсеместно. Они встречаются всюду, где есть бактерии - в почве, воде, кишечном тракте человека и животных, гнойных выделениях и т. п. Особенно много фагов в сточных водах; из этого источника можно выделить практически любой фаг. Поскольку естественной средой обитания любого фага является микробная клетка, жизнь фагов связана с бактериями.

В период между 1920 и 1940 гг. было проведено очень много работ, посвященных изучению возможности применения бактериофагов с терапевтической целью. В большинстве случаев результаты оказались сомнительными или неутешительными, но при некоторых заболеваниях, например при холере, удалось получить терапевтический эффект. С открытием более действенных химиотерапевтических препаратов интерес к применению фага значительно уменьшился. Первоначальные надежды на эффективность применения фага в медицине послужили стимулом для проведения многих ценных работ, касающихся специфичности, иммуногенности, стабильности и изменчивости, а также других свойств бактериофагов. В списке литературы по фагу значатся имена многих известных бактериологов и иммунологов - Борде. Круц, Дёрр, А. Флеминг, Одюруа, Левадити, Праусниц, Топлн, но лишь немногие ученые посвятили всю свою деятельность изучению фагов. Кроме ДЭрелля, это были Ашешов. Бронфенбреннер, Флу, Грациа, Е. Вольман и Е. Вольман (старшие). Эти ученые, интересовавшиеся биологией бактериофагов и возможностью их практического применения, внесли большой вклад в учение о фагах. Затем изучением фага занялись ученые, которые сочетали в своей работе биологическую «интуицию» с применением современных количественных методов исследования: Бернет, Шлезингер, Эндрьюс.

Теория происхождения

В своей первой работе Туорт (1915), рассматривая природу открытого им тогда еще не имевшего названия литического фактора, задавался вопросом - подобен ли этот фактор бактериям, простейшим или фильтрующимся вирусам; не является ли он фильтрующейся стадией жизненного цикла пораженного микрококка или, быть может, это бактериальный фермент, образующийся аутокаталитически при разрушении продуцирующего его микроорганизма. Ряд более тщательно разработанных гипотез приведен в к ниге ДЭрелля (1926). Из них только две сохранили свое значение до настоящего времени: «теория предшественника» и «теория вируса». Живая полемика между сторонниками этих двух теорий длилась много лет; она явилась стимулом для проведения многочисленных экспериментальных работ и породила специальную терминологию.

Согласно теории предшественника, бактериофаги возникают эндогенно: они существуют в бактериях в виде предшественников, которые спонтанно или под влиянием какого-то воздействия превращаются в характерные литические вещества, подобно тому как трипсиноген превращается в трипсин. Эту теорию поддерживали Гильдемейстер (1921), Борде (1925), Нортроп (1939а), Крюгер и Скрибнер (1939), а также Феликс (1953). В большинстве случаев экспериментальное подтверждение этой точки зрения получали при изучении лизогенных бактерий, что и будет рассмотрено ниже.

Признание того факта, что умеренные фаги способны существовать в трех различных состояниях, служит основой для объединения теории предшественника и теории вируса. Эндогенный предшественник в лизогенных бактериях - это по сути дела профаг определенного умеренного фага. Возможность такого объединения противоположных взглядов ясно предвидели Вернет и Мак-Ки (1929). Правда, остается невыясненным, в какой степени теория предшественника приложима к объяснению инфекции экзогенными фагами.

Недавно проведенные исследования установили выраженное сходство между физическими, химическими и биологическими свойствами бактериофагов и других вирусов. Благодаря этому сходству бактериофаги часто использовались в качестве модели вирусов животных, как это и было, например, в работах по изысканию противовирусных антибиотиков. Хотя до некоторой степени это было оправдано, вряд ли можно проводить подобную аналогию дальше. Судя по данным, изложенным ниже, вполне возможно, что бактериофаги и другие вирусы произошли от совершенно разных предков. Тому факту, что в известных нам бактериофагах содержится ДНК, тогда как в некоторых типичных вирусах растений и животных содержится РНК, следует, пожалуй, придавать больше значения, чем упомянутому выше, скорее случайному, сходству между бактериофагами и вирусами.

В настоящее время общепризнано, что фаги образуют группу весьма разнообразных по своим свойствам специфических бактериальных вирусов - ультрамикробов, претерпевших длительную эволюцию, связанную с адаптацией и специализацией. Сам Д"Эрелль не полностью разделял эту точку зрения; он считал, что все бактериофаги относятся к одному виду, хотя и представленному большим числом разнообразных форм. Утверждая это, Д"Эрелль и многие другие противники вирусной теории игнорировали или отрицали наиболее веские доводы этой теории, вследствие чего, к сожалению, основные исследования по фагам в течение 10 или более лет оказались бесплодными.

В открытом Д’Эреллем литическом цикле столь ярко выявилась активность бактериофагов, что другие их свойства почти не изучались. И лишь в последние годы, с открытием нелитической фазы фага, в изучении фагов появилось новое направление. Не-которые штаммы бактериофага, попадая в чувствительную культуру бактерий, способны вступать с ней в тесные симбиотические отношения, при которых клетка-хозяин продолжает размножаться, неся в себе вирус в неинфекционном состоянии на протяжении бесконечного числа делений. Это тонко уравновешенная фаза размножения вируса, во время которой инфицированная клетка-хозяин и находящийся в ней профаг размножаются с одинаковой скоростью; данное явление получило название «лизогенности», или «лизогении». Теперь считают, что инфицирование, приводящее к лизогенности, вызывает модификацию генетического аппарата бактериальной клетки и часто приводит к изменению свойств бактерий; в качестве примера укажем на превращение авирулентного штамма дифтерийной бактерии в высокотоксигенный под влиянием заражения соответствующим фагом.

При определенных условиях некоторые бактериофаги поражают и убивают чувствительные бактерии, не вызывая лизиса и не размножаясь. В этом случае фаговая частица ведет себя как антибиотик, а не как вирус. Некоторые антибиотики, продуцируемые бактериями, например колнцины и пиоцины, действительно по ряду свойств напоминают бактериофаги.